Pada tahun 1884, seorang bakteriologiwan Denmark secara kebetulan menemukan prosedur pewarnaan gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. (Hadieotomo,1988).
Ada 5 macam pewarnaan, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana, memungkinkan untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dalam morfologi yang sama,
2. Pewarnaan tahan asam, untuk pewarnaan bakteri yang mengandung sejumlah besar besar zat lipoid (berlemak) didalam dinding selnya yang menyebabkan tidak permeabel terhadap zat warna yang umum,
3. Pewarnaan spora, untuk pewarnaan bakteri yang membentuk endospora yang tahan terhadap kondisi ekstrim sehingga dibutuhkan perlakuan yang keras,
4. Pewarnaan kapsul, dan
5. Pewarnaa negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya hitam gelap. (Volk ,1992)
Komposisi dinding sel bakteri gram positive berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding sel yang lebih yang tebal pada bakteri gram positive menyusul oleh perlakuan alkohol karena terjadi dehidrasi. Sedangkan sel-sel gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Contoh dari gram positive adalah S.aureus dan gram negative adalah E.coli. (Hadioetomo, 1988).
Perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positive dan gram negative sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri gram positive terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram negative mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram negative (Lay,1994).
Pewarnaan gram/diferensial memerlukan sekurang-kurangnya tiga macam reagen bahan kimia yang dipakai pada film bakteri yang sudah difiksasi. Zat kimia pertama disebut zat warna utama. Fungsi zat ini adalah untuk memberikan warna pada semua sel bakteri. Agar diperoleh warna yang kontras, zat kimia kedua yang dipakai adalah zat penghilang warna (decolourizing agent). Berdasarkan komposisi kimia komponen sel bakteri, maka zat kimia yang kedua tersebut dapat atau tidak dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari semua bagian sel atau hanya dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari bagian sel tertentu dalam struktur bakteri. Zat kimia yang terakhir, yaitu lawan warna (counterstain) memiliki sifat warna yang kontras dengan zat warna yang pertama. (Subandi, 2010)
Peluntur cat yang digunakan untuk mendapat kontras yang baik pada bayangan mikroskop antara lain:
1. Bahan peluntur untuk lemak: air, aceton, alcohol
2. Bahan peluntur untuk cat basa: HCl, H2SO4, HNO3, dsb.
3. Bahan peluntur untuk cat asam: KOH encer, sabun
4. Garam - garam logam berat: AgNo3, CuSo4, dsb.
5. Garam- garam logam ringan: Na2SO4, MgSo4, dsb. (Tim bakteriologi umum, 2005)
Sifat gram ditentukan oleh sifat- sifat fisik dan kimia dinding dan membran selnya. Selama proses pewarnaan, penambahan alcohol terhadap bakteri gram negative menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes/permeabilitas dinding sel gram negative. Jadi kompleks Kristal violet-Iodium (lugol) yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam pewarnaan dapat diekstraksi. Karena itu gram negative kehilangan warna tersebut. Karena kandungan lipidnya lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan alcohol. Ukuran pori-pori mengecil, permeabilitas berkurang dan kompleks Kristal violet–iodium tidak dapat terekstraksi. Pada saat pemberian cat penutup (safranin), bakteri gram negative terwarnai sehingga berwarna merah, bakteri gram positif tidak terwarnai sehingga berwarna ungu. (Tim bakteriologi umum, 2005)
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu :
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan ±terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
4. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. (Hadiotomo, 1990)
Sedangkan ciri-ciri bakteri gram positif yaitu :
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. (Hadiotomo, 1990)
B. Alat dan Bahan
No
|
Alat
|
Bahan
|
1
|
Kertas saring
|
Preparat bakteri: Staphilococcus aureus, Bacillus substilis, Sarcina lutea, Eschericia coli, Proteus vulgaris
|
2
|
Jarum Ose
|
Zat warna fuchsin/ safranin, Gentian violet,
|
3
|
Bunsen Spirtus
|
larutan violet/ lugol,
|
4
|
Kaca Objek
|
Alcohol 95%
|
5
|
MIkroskop
|
Aquadest
|
C. Cara Kerja
D. Hasil Pengamatan
No
|
Foto
|
Gambar literatur
|
Klasifikasi
|
1.
| 
Staphylococus aureus
Pembesaran 10x10
| 
forbes.com
| |
2.
| 
Bacilus substilis
Pembesaran 10x40
Gram positif
| 
ardiunikal.blogspot.com
|
Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Order : Bacillales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus subtilis
|
3.
| 
Sarcina lutea
Pembesaran 10x10
Gram positif
| 
modmedmicrobes.wikispaces.com
|
Genus : Sarcina
Spesies : Sarcina lutea
|
4.
| 
Escherichia coli
Pembesaran 10x40
Gram negatif
| 
fermanagh.gov.uk
|
Spesies : Escherichia coli
|
5.
| 
Proteus vulgaris
Pembesaran 10x40
Gram negatif
| 
rci.rutgers.edu
|
Kingdom : Bacteria
Phylum : Proteobacteri
Class : Gammaproteobacteria
Order : Enterobacteriales
Family : Enterobacteriaceae
Genus : Proteus
Species : Proteus vulgaris
|
E. Pembahasan
Bakteri yang termasuk gram positif antara lain:
1. Staphylococus aureus
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).
Peran S. aureus , diantaranya penyebab bisul, jerawat, pneumonia, meningitis, dan arthritits. Sebagian besar penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini memproduksi nanah, oleh karena itu bakteri ini disebut piogenik. S. aureus juga menghasilkan katalase, yaitu enzim yang mengkonversi H2O2 menjadi H2O dan O2, dan koagulase, enzim yang menyebabkan fibrin berkoagulasi dan menggumpal. Koagulase diasosiasikan dengan patogenitas karena penggumpalan fibrin yang disebabkan oleh enzim ini terakumulasi di sekitar bakteri sehingga agen pelindung inang kesulitan mencapai bakteri dan fagositosis terhambat.
2. Bacillus subtilis
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang, dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).
3. Sarcina lutea
Sarcina lutea, merupakan bakteri nonmotile, gram positif, aerob (fakultatif anaerobik), Micrococcus penghasil pigmen, dapat ditemukan di udara, tanah, dan air di seluruh bumi. Bakteri ini sensitive terhadap penisilin. Koloni berwarna kuning.
Sedangkan bakteri yang termasuk gram negative adalah:
1. Escherichia coli
Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan Escherichia coli tidak berbahaya, tetapi beberapa, seperti Escherichia coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada manusia yaitu diare berdarah karena eksotoksin yang dihasilkan bernama verotoksin. Toksin ini bekerja dengan cara menghilangkan satu basa adenin dari unit 28S rRNA, sehingga menghentikan sintesis protein. Sumber bakteri ini contohnya adalah daging yang belum masak, seperti daging hamburger yang belum matang.
Escherichia coli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K2, atau dengan mencegah baketi lain di dalam usus. Escherichia coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. Escherichia coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya.
2. Proteus vulgaris
Proteus Vulgaris berbentuk batang, bakteri gram negatif yang menghuni saluran usus manusia dan hewan. Bakteri ini dapat ditemukan di tanah, air dan tinja. Bakteri ini dikelompokkan dengan Enterobacteriaceae dan merupakan patogen oportunistik manusia. Bakteri ini diketahui menyebabkan infeksi saluran kemih dan infeksi luka.
Peran: Proteus mirabilis menyebabkan 90% dari infeksi Proteus. Proteus vulgaris dan Proteus penneri mudah diisolasi dari individu dalam jangka panjang fasilitas perawatan dan rumah sakit dan dari pasien dengan penyakit yang mendasari atau sistem kekebalan tubuh dikompromikan. Pasien dengan infeksi berulang, orang-orang dengan kelainan struktural dari saluran kemih, mereka yang memiliki instrumentasi uretra, dan mereka yang diperoleh infeksi di rumah sakit mengalami peningkatan frekuensi infeksi yang disebabkan oleh Proteus dan organisme lain (misalnya, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas , enterococci, staphylococci)
F. Pertanyaan dan Jawaban
1. Apa yang dimaksud dengan pewarnaan majemuk?
Jawab:
Pewarnaan yang menggunakan dua jenis zat warna yang dilakukan secara bertingkat sifat gram terutama ditentukan oleh sifat fisik dan kimia pada dinding sel dan membrane sitoplasma.
2. Mengapa perlu dilakukan pencucian dalam alcohol?
Jawab:
Unruk menghilangkan zat warna yang pertama. Alcohol dapat menghilangkan zat warna tersebut karena alcohol larut dalam lemak.
3. Mengapa hasil warna sel bakteri yang diperoleh antara gram positif dan gram negatif berbeda/ jelaskan !
Jawab:
Sifat gram (hasil warna) tersebut ditentukan oleh sifat- sifat fisik dan kimia dinding dan membran selnya.
4. Adakah kesimpulan yang bisa anda dapatkan dari pewarnaan majemuk ini?
Jawab:
a. Pewarnaan gram dapat digunakan sebagai salah satu cara bentuk mempermudah mengamati morfologi bakteri.
b. Bakteri yang termasuk gram positif adalah Staphylococus aureus , Bacillus subtilis, dan Sarcina lutea. Sedangkan bakteri yang termasuk gram negative ialah Escherichia colidan Proteus vulgaris.
c. Sifat gram (hasil warna) ditentukan oleh sifat- sifat fisik dan kimia dinding dan membran selnya
G. Kesimpulan
Dari hasil pengamatan dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut:
a. Pewarnaan gram dapat digunakan sebagai salah satu cara bentuk mempermudah mengamati morfologi bakteri.
b. Bakteri yang termasuk gram positif adalah Staphylococus aureus , Bacillus subtilis, dan Sarcina lutea. Sedangkan bakteri yang termasuk gram negative ialah Escherichia colidan Proteus vulgaris.
c. Sifat gram (hasil warna) ditentukan oleh sifat- sifat fisik dan kimia dinding dan membran selnya.
DAFTAR PUSTAKA
Hadioetomo. 1988. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia:Jakarta.
Lay dan Hartono.1992. Mikrobiologi. Jakarta : Rajawali Pers.
Subandi. 2010. Mikrobiologi. Bandung : PT Remaja Rosda Karya
Tim Bakteriologi Umum. 2005. Diktat Penuntun Praktikum Mikroskop Dan Bakteriologi Umum. Tasik: Akademui Analis Kesehatan Bakti Husada.
Volk, Wheter. 1992. Mikrobiologi Dasar. University Of Southern Maine.
Waluyo. 2008. Mikrobiologi Umum. UMM Press:Malang.
http://putrabakaudotblogspotdotcom.wordpress.com/2012/06/22/pewarnaan-gram-2/ [diakses tanggal26 desember 2012]
http://wawan-junaidi.blogspot.com/2010/02/makalah-tentang-pewarnaan-gram-atau.html [diakses tanggal26 desember 2012]
http://id.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus [diakses tanggal26 desember 2012]
